Spisu treści:
- 01 Czyste warunki laboratoryjne
- 02 Składniki chemiczne
- 03 Mix mieszaniny reakcyjnej: szablon i podkłady
- 04 Mieszanka reakcyjna: aktywność enzymu
- 05 Typ Thermocycler
- 06 Ustawienia cyklu
Wideo: Jak wdrożyć RODO w małej lub średniej firmie - Seminarium z cyklu „Europejskie Przedsiębiorstwo” 2024
Korekty dowolnego składnika reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) mogą wpłynąć na jakość wyniku, albo poprzez polepszenie lub zmniejszenie wydajności i jakości produktu, albo przez poprawę specyficzności i wrażliwości reakcji. Parametry wpływające na wynik końcowy mogą być fizyczne (np. Temperatura, czasy cyklu) lub chemiczne (np. Stężenie matrycy, typ zastosowanego enzymu). Poniżej przedstawiono kilka kluczowych czynników, które mają wpływ na powodzenie PCR.
01 Czyste warunki laboratoryjne
Ponieważ PCR jest zdolny do wykrywania pojedynczej cząsteczki DNA, ważne jest utrzymanie w laboratorium nieskazitelnych warunków. Zawsze noś świeże rękawiczki; używać sterylnych naczyń szklanych, tubek i końcówek do pipet; i wyczyść obszar roboczy przed rozpoczęciem pracy.
Zawsze włączaj reakcje kontrolne, bez matrycowego DNA i bez enzymu, aby zapewnić, że wyniki są naprawdę wynikiem amplifikacji właściwej próbki.
Większość ludzi musi mieć własny zestaw rozwiązań, które nie są udostępniane, aby ułatwić rozwiązywanie problemów, a wyznaczone pipety są często zarezerwowane tylko dla PCR. Rurki PCR z DNazą i RNazą, końcówki do pipet odpornych na działanie aerozolu i pracujące w wyciągu z lampą UV to również sposoby na zminimalizowanie problemów.
02 Składniki chemiczne
Istotne znaczenie ma również czystość i integralność matrycy (oczyszczonego DNA) i projektu podkładu. W Internecie dostępnych jest kilka programów do projektowania podkładów. Najlepsze podkłady:
- Ma 18 do 24 zasad
- Nie mają struktury drugorzędnej (np. Pętli spinki do włosów)
- Mają zrównoważoną dystrybucję par G / C i A / T
- Nie są ze sobą komplementarne na końcach 3 stóp
- Mieć temperaturę topnienia (Tm) około 5-10 stopni Celsjusza poniżej temperatury wyżarzania, która zwykle wynosi od 55 do 65 stopni Celsjusza. Tm dla obu starterów również powinno być podobne dla uzyskania najlepszych rezultatów.
03 Mix mieszaniny reakcyjnej: szablon i podkłady
Proporcje mieszaniny reakcyjnej mają ogromny wpływ na jakość wyników PCR. Istnieje ogólna formuła dla stężenia matrycy, enzymu, starterów i nukleotydów do użycia, ale można to nieco poprawić.
Optymalne stężenia starterów wynoszą od 0,1 do 0,6 mikromoli / litr. Ilość matrycy zmienia się w zależności od rodzaju DNA (ludzkiego, bakteryjnego, plazmidowego).
Przy bardzo małych ilościach szablonów istnieją inne strategie poprawy wyników, takie jak zwiększenie liczby cykli lub użycie "gorącego startu". Zawsze testuj nowe startery z pozytywną reakcją kontrolną, aby mieć pewność, że działają one w określonych warunkach eksperymentalnych.
04 Mieszanka reakcyjna: aktywność enzymu
Wybór polimerazy DNA wpływa na dokładność reakcji i jakość produktu. Tradycyjna polimeraza Taq została zastąpiona w wielu laboratoriach przez enzymy o większej wierności (te, które powodują mniej błędów).
Stężenie MgCl2 w mieszaninie reakcyjnej może wpływać na wynik PCR i może odgrywać ważną rolę w bardziej wymagających reakcjach. Kation magnezowy tworzy rozpuszczalne kompleksy z dNTP w celu wytworzenia właściwego substratu, który rozpoznaje enzym polimerazy.
Równe ilości wszystkich czterech dNTP również pomagają zmniejszyć współczynnik błędu polimerazy. Niektóre dodatki, takie jak betaina, BSA, detergenty, DMSO, glicerol i pirofosfatazy, mogą również wpływać na swoistość enzymu lub wydajność reakcji.
05 Typ Thermocycler
Robiąc zakupy na sprzęty laboratoryjne, pamiętaj, że niektóre termocyklery są mniej precyzyjne niż inne przy zachowaniu dokładnych, pożądanych temperatur.
Jest to dziedzina, w której taniej nie opłaca się na dłuższą metę, gdy czeka cię drobna reakcja lub stosowanie gruntów wymagających wąskiego zakresu temperatur wyżarzania.
Cienkościenne rury reakcyjne zaprojektowane tak, aby pasowały do precyzyjnej marki termocyklera, z którego korzystasz, pomagają zoptymalizować temperaturę reakcji.
06 Ustawienia cyklu
Długości cykli reakcji, temperatury i liczba cykli mają decydujący wpływ na to, jak dobrze będzie działała reakcja PCR. Początkowy etap ogrzewania musi być wystarczająco długi, aby całkowicie zdenaturować matrycę, a cykle muszą być wystarczająco długie, aby zapobiec stopieniu się samego DNA.
Zwiększenie wydajności można uzyskać przez wydłużenie czasu rozciągania około co 20 cykli, aby zrekompensować mniej enzymu w celu wzmocnienia większej ilości matrycy. Zwykle wystarcza mniej niż 40 cykli do powielenia mniej niż 10 cząsteczek matrycy do stężenia wystarczająco dużego, aby zobaczyć na żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny.
Wymagane a nie wymagane świadczenia pracownicze
Dowiedz się, jakie prawa obowiązują w zakresie świadczeń pracowniczych i co pracodawcy mają nadal swobodę w projektowaniu pakietów świadczeń.
7 pytań, które mogą pomóc w wyborze lepszych zapasów
Kiedy inwestujesz pieniądze swojej rodziny w akcje, istnieje siedem pytań, które mogą poprawić twoje szanse uniknięcia błędów i zwiększenia twojego bogactwa.
Co to jest wadium i dlaczego jest wymagane?
Zapoznaj się z podstawowymi zasadami składania ofert na projekty budowlane, w tym na temat ich działania, sposobu użytkowania i prawdopodobieństwa poniesienia kosztów.